生物發(fā)酵罐的滅菌效果驗(yàn)證是確保無菌生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需通過物理、化學(xué)和微生物學(xué)多維度方法綜合評估，具體驗(yàn)證流程和要點(diǎn)如下：
 

　　一、物理驗(yàn)證：監(jiān)測滅菌參數(shù)
 

　　核心目標(biāo)：確認(rèn)滅菌過程中溫度、壓力、時(shí)間等物理參數(shù)達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。
 

　　1. 溫度驗(yàn)證
 

　　- 測量工具：
 

　　- 高精度溫度記錄儀(精度±0.5℃)或無線溫度傳感器，至少布置3個(gè)測溫點(diǎn)(罐體頂部、底部、幾何中心)，復(fù)雜罐體(如帶盤管、擋板)需增加布點(diǎn)(如夾套進(jìn)出口、攪拌軸附近)。
 

　　- 熱電偶或熱電阻探頭需通過校準(zhǔn)(溯源至國家標(biāo)準(zhǔn))，驗(yàn)證前用標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)比對。
 

　　- 操作要點(diǎn)：
 

　　- 空載驗(yàn)證：空罐滅菌時(shí)，記錄升溫速率(如從常溫升至121℃的時(shí)間應(yīng)<15分鐘)、保溫階段溫度均勻性(各點(diǎn)溫差≤±1℃)、維持時(shí)間(通常121℃保持20–30分鐘，根據(jù)罐體容積調(diào)整)。
 

　　- 滿載驗(yàn)證：模擬實(shí)際生產(chǎn)狀態(tài)，裝入培養(yǎng)基或等效負(fù)載(如生理鹽水)，重復(fù)上述測試，重點(diǎn)關(guān)注冷點(diǎn)位置(如罐體底部角落、管道死角)的溫度是否達(dá)標(biāo)。
 

　　2. 壓力驗(yàn)證
 

　　- 測量工具：
 

　　- 罐體自帶壓力表(精度±0.01 MPa)與獨(dú)立壓力變送器同步監(jiān)測，驗(yàn)證前用標(biāo)準(zhǔn)壓力計(jì)校準(zhǔn)。
 

　　- 操作要點(diǎn)：
 

　　- 確認(rèn)滅菌過程中罐內(nèi)壓力與溫度對應(yīng)(如121℃時(shí)壓力應(yīng)為0.1–0.15 MPa)，壓力波動(dòng)范圍≤±0.02 MPa，避免因壓力不足導(dǎo)致溫度未達(dá)滅菌閾值。
 

　　二、化學(xué)驗(yàn)證：使用指示物監(jiān)測
 

　　核心目標(biāo)：通過化學(xué)物質(zhì)的特性變化直觀判斷滅菌是否徹-底。
 

　　1. 化學(xué)滅菌指示膠帶/標(biāo)簽
 

　　- 原理：膠帶含熱敏化學(xué)顏料，滅菌后顏色由淺變深(如米白色→深褐色)，需選擇標(biāo)有“121℃/30分鐘”或“134℃/3分鐘”等明確滅菌條件的產(chǎn)品。
 

　　- 使用方法：
 

　　- 粘貼于罐體內(nèi)部難監(jiān)測區(qū)域(如管道彎頭、閥門內(nèi)側(cè))、過濾器濾芯表面、攪拌軸密封處等，至少布置5–10個(gè)點(diǎn)。
 

　　- 滅菌后觀察顏色變化，未變色區(qū)域視為滅菌不徹-底，需分析原因(如蒸汽流通不暢)。
 

　　2. 化學(xué)指示劑(如留點(diǎn)溫度計(jì))
 

　　- 原理：基于低熔點(diǎn)合金或化學(xué)試劑的熔融特性，如121℃留點(diǎn)溫度計(jì)內(nèi)含易熔合金，滅菌后需人工折斷驗(yàn)證是否熔化。
 

　　- 使用方法：
 

　　- 放置于罐體冷點(diǎn)(通過物理驗(yàn)證預(yù)確認(rèn))，滅菌后取出觀察，合金熔化表明該點(diǎn)溫度達(dá)到滅菌要求。
 

　　三、微生物學(xué)驗(yàn)證：生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)
 

　　核心目標(biāo)：通過定量接種耐熱微生物孢子，驗(yàn)證滅菌工藝的致死能力(即殺滅對數(shù))。
 

　　1. 生物指示劑(BI)選擇
 

　　- 菌種：
 

　　- 需氧菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)孢子，耐熱性強(qiáng)(D值=1.5–3分鐘@121℃)，適用于濕熱滅菌驗(yàn)證。
 

　　- 厭氧菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)孢子，更常用(D值=1.5–3分鐘@121℃)，適用于密封罐體滅菌。
 

　　- 孢子濃度：每支BI含1×10?–1×10? CFU( Colony Forming Unit，菌落形成單位)，確保滅菌后殺滅對數(shù)≥6(即存活概率<10??)。
 

　　2. 布點(diǎn)與操作
 

　　- 布點(diǎn)原則：
 

　　- 覆蓋所有可能的滅菌死角：罐體底部排水口、進(jìn)料管末端、空氣分布器、換熱器盤管死角、閥門盲端等。
 

　　- 每個(gè)關(guān)鍵位置放置2支BI(平行樣)，總布點(diǎn)數(shù)≥10個(gè)(小型罐)或≥20個(gè)(大型罐)。
 

　　- 操作步驟：
 

　　1. 將BI放入透氣性包裝(如無紡布)，避免直接接觸蒸汽導(dǎo)致孢子提前失活。
 

　　2. 滅菌前按布點(diǎn)圖固定BI，可通過支架或耐高溫膠帶定位。
 

　　3. 滅菌后取出BI，一支進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯，55–60℃培養(yǎng)48–72小時(shí))，另一支作為陽性對照(不滅菌直接培養(yǎng))。
 

　　4. 結(jié)果判定：培養(yǎng)后觀察是否有渾濁或菌落生長，若所有BI均無菌生長，視為滅菌合格；若有陽性結(jié)果，需擴(kuò)大驗(yàn)證范圍并調(diào)整滅菌參數(shù)(如延長保溫時(shí)間、提高溫度)。
 

　　四、驗(yàn)證周期與異常處理
 

　　1. 常規(guī)驗(yàn)證周期
 

　　- 定期驗(yàn)證：
 

　　- 新建/改造罐體：投產(chǎn)前需通過至少3次連續(xù)成功的驗(yàn)證(物理+化學(xué)+微生物)。
 

　　- 正常生產(chǎn)：每6–12個(gè)月進(jìn)行一次全面再驗(yàn)證，每年至少一次微生物學(xué)驗(yàn)證。
 

　　- 觸發(fā)再驗(yàn)證場景：
 

　　- 更換滅菌工藝參數(shù)(如溫度從121℃調(diào)整為123℃)、罐體結(jié)構(gòu)改造(如新增管道)、滅菌失敗事件(如染菌批次)后。
 

　　2. 異常情況處理
 

　　- 物理參數(shù)不達(dá)標(biāo)：
 

　　- 檢查蒸汽供應(yīng)(壓力、干度)、疏水閥是否堵塞、罐體保溫層破損等，修復(fù)后重新驗(yàn)證。
 

　　- 化學(xué)/微生物驗(yàn)證失敗：
 

　　- 分析滅菌死角原因(如管道坡度不足導(dǎo)致冷凝水滯留)，通過增加布點(diǎn)、調(diào)整滅菌程序(如預(yù)排水時(shí)間從5分鐘延長至10分鐘)或機(jī)械改造(如打磨焊縫消除死角)解決，直至驗(yàn)證通過。
 

　　五、文件記錄與合規(guī)性
 

　　1. 驗(yàn)證報(bào)告內(nèi)容：
 

　　- 物理參數(shù)記錄(溫度-時(shí)間曲線、壓力波動(dòng)圖)。
 

　　- 化學(xué)指示劑變色情況(附照片或圖示)。
 

　　- 生物指示劑培養(yǎng)結(jié)果(菌落計(jì)數(shù)表、陰性/陽性對照記錄)。
 

　　2. 合規(guī)性要求：
 

　　- 符合GMP(藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)、FDA(美國食品藥品監(jiān)督管理局)或ISO 13485(醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系)等標(biāo)準(zhǔn)，記錄需存檔至少3–5年。
 

　　- 若用于制藥行業(yè)，需通過PQ(性能確認(rèn))階段的微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)，證明滅菌工藝的重現(xiàn)性和可靠性。
 

　　發(fā)酵罐滅菌效果驗(yàn)證需遵循“科學(xué)布點(diǎn)、多方法交叉驗(yàn)證、動(dòng)態(tài)監(jiān)控”原則，通過物理參數(shù)的精準(zhǔn)控制、化學(xué)指示物的直觀反饋和生物指示劑的定量挑戰(zhàn)，確保滅菌無-死角、工藝穩(wěn)定可靠。
 

　　實(shí)際操作中，可結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評估(如高附加值產(chǎn)品需提高驗(yàn)證頻次)和數(shù)字化工具(如實(shí)時(shí)溫度云圖系統(tǒng))提升驗(yàn)證效-率，最終保障發(fā)酵過程的無菌環(huán)境。